缺血预适应对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护性作用研究

【摘要】在我国,肝病发病率较高,各类肝炎、肝硬化、肝癌、先天性与代谢性肝病等,一般的药物治疗和外科手术治疗难以达到满意的效果。因此,对肝脏移植手术有很大的需求。由于肝脏功能复杂、手术难度大、术后管理困难等因素,但肝脏在移植过程中往往会遭受不同程度的各种损伤,从而导致供肝术后肝功能不全、原发性移植肝无功能(Primarygraftnon-function,PNF)和移植物功能延迟恢复(delayedgraftfunction,DGF)等。移植后肝功能不良和供肝保存欠佳、缺血再灌损伤(Ischemia-reperfusion,I/R)关系极为密切。研究表明,肝脏缺血再灌注损伤是导致早期移植后肝功能不全的最常见原因之一,同时也是影响肝移植手术后移植物长期存活的重要因素。我国又是世界上终末期肝病发病率最高的地区之一,肝病患者众多,肝脏供需矛盾突出。因此,寻找一种安全有效的移植肝保存法,探究肝移植缺血再灌损伤机制已成为重要的研究课题。肝移植缺血再灌注损伤及相应炎症反应常导致肝细胞损伤及坏死,如何避免肝细胞缺血再灌注损伤对疾病的治疗及预后有着重要的价值。缺血预适应(Ischemicpreconditioning,IPC),也叫缺血预适应,是一种通过预先短暂缺血以耐受随后较长时间的缺血损伤,并减轻组织后续缺血再灌注损伤的现象。1986年Murry等首次提出了缺血预处理这一概念。Laskey和Szmagala的临床研究指出,缺血预适应可预防经皮腔内冠状动脉成形术(Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)和心脏手术所致的心肌缺血损伤。Toosy等首次研究发现了肾脏IPC对肾组织学损伤也具有保护作用。研究表明缺血预适应现象在其它许多器官都存在,如脑、肝、小肠、骨骼肌、肾和肺等,而且各组织器官之间存在交叉缺血耐受现象,例如骨骼肌、肾脏的短暂性缺血可有效减轻冠状血管阻塞所致的心肌梗死灶的容积。缺血预适应对大鼠字体肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制还不明确,是与临床肝移植手术减少肝组织损伤密切相关的课题。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)是细胞因子的核心成员之一,是广泛表达于活化的B细胞、静止的T细胞、骨髓瘤细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、髓样白血病细胞等细胞表面的一种具有多种生物学活性的刺激因子。IL-6主要由单核巨噬细胞和成纤维细胞产生,人类IL-6是由213个氨基酸组成的,可由肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,T]NF)诱导产生并可增加TNF的有害作用,它具有诱导T、B淋巴细胞分化、刺激肝细胞合成急性期反应蛋白、催化和放大炎性反应和毒性等作用,对组织和细胞产生损害。IL-6作为一种多效性细胞因子,是参与免疫调节和炎性反应的重要因子之一,是机体对感染和组织损伤所引起应答反应的主要介质,能够和集落刺激因子(Colony-stimulatingfactor,CSF)协同作用,促进骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能。病毒、细菌感染均能诱导体内IL-6表达增加,在多种自身免疫疾病和肿瘤疾病中也表达异常。作为机体的保护机制,血清中IL-6水平升高对机体清除感染的病毒起到重要作用,此外,研究指出IL-6的表达水平与感染的严重程度、炎症反应的程度呈正相关,可作为判断病情严重程度的灵敏指标。本研究首先构建大鼠自体肝移植缺血再灌注损伤模型,对缺血预适应组和对照组大鼠肝组织受损情况进行病理分析,然后对相关指标血浆谷草转氨酶(Alanineaminotransferase,ALT)和谷丙转氨酶(Aspartateaminotransferase,AST)的含量、IL-6的表达、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量进行检测,分析血浆中IL-6、TNF-α和IL-1p的表达在缺血预适应组与对照组的差异,以及与肝组织损伤程度的相关性和可能的作用机制。本文旨在对肝移植缺血再灌注损伤的机制和保护性预适应进行研究,为肝移植缺血再灌注损伤的临床治疗和保护提供新的依据。方法首先建立大鼠门静脉灌注的自体肝移植缺血再灌注模型,健康、成年、雄性SPF级纯系SD大鼠72只,体重约280-300g,由南方医科大学实验动物中心提供。大鼠常规饲养,术前禁食12h,不禁水。将72只SD大鼠随机分为3组：正常大鼠对照组(A组)、大鼠肝移植组(B组)和缺血预适应大鼠肝移植组(C组)。B组大鼠直接行肝移植术。C组大鼠术前行肝脏缺血预适应,即夹闭肝门部肝动脉及门静脉15min,后回复肝脏供血,20min后行大鼠自体肝移植。采用乙醚棉球对准大鼠口鼻行开放式吸入麻醉。常规备皮、消毒后,取腹正中切口入腹。进腹后先用棉签将整个肠道翻出腹腔外以利于术野暴露。然后用组织剪游离肝镰状韧带后切断,向右翻动肝左叶和中叶,暴露肝食管韧带,结扎、切断肝食管韧带内血管,并以此为起点逆时针游离肝脏。首先沿食管向上分离,切断左三角韧带,缝扎、切断左膈血管。然后向左翻转肝脏,切断右三角韧带。再继续向上游离肝上下腔静脉(Suprahepaticvenacava,SVC)至膈静脉裂孔,然后向下游离腔静脉至右肾静脉水平,期间结扎、切断腰静脉。游离肝肾韧带,结扎切断右肾上腺静脉。肝脏复位,游离肝下下腔静脉(Infrahepaticvenacava,IVC),将其分离至左肾静脉水平以上。打开肝十二指肠韧带,找出肝动脉(Hepaticartery,HA),将其分离并于动脉后方过线以备阻断。继续从肠系膜下静脉和脾静脉汇合处游离门静脉(Portalvein,PV)至肝门部,期间需结扎幽门静脉。最后钝性分离肝胃韧带,将肝两片叶游离出来。至此肝脏全部游离完毕。将稀释后的肝素注射液(35U/L)3mL通过穿刺针灌入门静脉,使其完全肝素化。在髂总动脉与左肾动脉之间向近心端穿刺腹主动脉,用血管夹固定穿刺针,在腹腔干以上和穿刺点以下上血管夹阻断。同时在SVC、IVC右肾静脉水平上血管夹,并在IVC血管夹稍上方纵行剪开约1mm静脉壁作为流出道。然后以2.5mL/min速度通过输液泵同时经PV、腹主动脉穿刺处灌注4℃含肝素(12.5U/mL)的乳酸林格氏液20mL,在此同时不断用4℃乳酸林格氏液浇注肝脏表面迅速降温。当肝脏颜色变为均匀土黄色时,灌注结束。灌注完成后拔出穿刺针,修补PV和腹主动脉穿刺点,用8-0prolene缝线修补IVC流出道,在肝动脉预留线处阻断肝动脉并上血管夹,然后松开PV、SVC、IVC、腹主动脉的血管夹,恢复肝脏血供,结束无肝期。并同时用38℃生理盐水浇注肝脏表面,快速复温。肝动脉开放后,观察腹腔内无出血点,连续缝合关腹。术后对大鼠进行灯照复温,直至麻醉清醒可以站立。各组大鼠再灌注2h、6h、12h和24h后,将大鼠麻醉,从下腔静脉采血5ml,离心后吸取血清,-80℃冰箱保存,用于ALT.AST检测。切取被阻断的肝组织,林格氏液洗净血液,修成小块(厚度不超过0.5cm),一部分用10%中性甲醛固定,一部分保存于-80℃冰箱。术后使用肝脏石蜡切片进行HE染色和电子显微镜观察大鼠肝脏组织的病理学改变和肝细胞中线粒体显微结构的变化。在各组大鼠缺血再灌注后2h、6h、12h、24h后,检测血清中谷丙转氨酶(Alanineaminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartateaminotransferase,AST)、以及肝脏组织超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)的活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,并采用多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术检测肝组织中IL-6的表达水平,采用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清中NF-α和IL-1β的水平。实验数据均用x±s表示,所有数据均采用IBMSPSS20.0统计软件包进行数据分析,统计数据采用析因设计方差分析。统计分析中,检验标准为α=0.05。结果1.大鼠再灌注后血清ALT和AST水平我们检测了各组大鼠血清中ALT和AST的含量,结果表明再灌注2h后,B组和C组的ALT和AST含量最高,术后24h大鼠血清ALT和AST值逐渐降低。在各时间段中,B组和C组的血清ALT和AST水平显著高于A组,但C组的血清ALT和AST水平在个时间段均低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.肝脏组织病理改变HE染色结果显示对照组肝细胞索排列正常、肝窦内皮细胞均正常；B组大鼠再灌注后12h,中央静脉周围的肝细胞明显肿胀,肝血窦变窄,肝小叶结构不明显,伴有红细胞和血栓,周围出现浸润的炎症细胞；C组大鼠肝小叶结构基本正常,肝细胞轻微肿胀,肝组织无明显改变。3.肝细胞的超微结构损伤缺血再灌注后12h,B组大鼠肝细胞线粒体体积大小不一,呈明显肿胀状态,呈类圆形,内有空泡变性,严重者可见嵴减少、断裂或消失,周围内质网结构分别不清；C组大鼠肝细胞线粒体轻微肿胀,呈椭圆形,内嵴部分断裂,多数正常排列,周围内质网结构尚存。4.缺血预适应降低缺血再灌注后肝脏IL-6的表达RT-PCR结果显示：B组各时间点的IL-6表达量均高于A组,C组6h、12h和24hIL-6表达量均高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。B组中,再灌注后12hIL-6的表达最高,之后呈下降趋势；C组2h、6h和12h的IL-6表达量均低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.各组大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平变化ELISA结果显示,与正常对照组相比,缺血再灌注损伤后B组和C组大鼠血清中TNF-a和IL-1p水平有不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.05),在I/R后12h达到峰值；I/R后6h、12h、14hC组大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平均低于B组(P<0.05)。6.各组肝脏组织中SOD及MDA的表达变化实验结果发现,B组与C组肝组织中的SOD活性均低于A组。各时间段中,C组SOD的表达略高于B组,其中术后6h和12h的差异有统计学意义(P<0.05)。B组与C组肝组织中的MDA达均高于A组。各时间段中,C组MDA的表达略低于B组,其差异有统计学意义(P<0.05)。与B组相比,C组的肝组织在各时相中的丙二醛呈低水平表达,超氧化物歧化酶活性较高,提示C组的自由基水平低于B组。结论缺血预适应对大鼠肝移植缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,能够显著降低IL-6,TNF-a和IL-1p的表达,降低肝细胞线粒体的损伤,在临床中有一定的作用及意义。
【作者】崔忠林；
【导师】周杰；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】缺血；预适应；缺血再灌注损伤；IL-6；TNF-α；IL-1β；

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